Expressão transiente de CRISPR em soja para triagem simplificada de gRNA na planta

Resumo

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método para criar e validar sistemas CRISPR-Cas e diferentes gRNAs em embriões de soja (Glycine max). Dois genes modelo foram usados para mutação simples com um gRNA ou deleção parcial do gene com dois guias. Os gRNAs foram inseridos nos vetores de transformação CRISPR por uma enzima de restrição do tipo IIS ou por subclonagem e inserção do promotor + gRNA2 no vetor de transformação final, com uso do método clássico de clonagem por enzimas de restrição. Os vetores foram construídos com sucesso para um e dois gRNAs. A transformação transiente de soja por Agrobacterium foi realizada para testar a qualidade dos gRNAs e do próprio sistema (cassete de expressão). Detectaram-se mutação simples e deleção gênica nos embriões transformados após o enriquecimento do DNA por digestão seguida de reação em cadeia da polimerase e sequenciamento, o que indica que o sistema CRISPR-Cas e os guias estavam funcionando. Este protocolo pode ser usado para acelerar as estratégias de edição de genoma baseadas em CRISPR, para transformação genética em soja.